A modellszervezet előnyei az algatoxinok vizsgálata szempontjából:
• csigák a gerinces szervezetekhez hasonló viselkedési mintázatokat mutatnak (pl. táplálkozás, légzés, tanulás és emlékezés)
• a viselkedési mintázatok kialakításáért felelős egyszerű idegi hálózatok és azonosított idegsejtek jellemzik
• a felszínen elhelyezkedő, kb. 20 000 idegsejt narancsosan pigmentált, többségében nagyméretű (50-100 µm)
• az idegsejtek szintjén, a gerincesekkel azonos intracelluláris és molekuláris folyamatok jellemzik
A kontrollált laborkísérletekben, a saját tenyészetünkből származó felnőtt egyedek (3-5 hónapos) egy-egy csoportját (12 állat/csoport) akut (rövid távú) és krónikus (hosszabb távú) cianotoxin kezelésnek tesszük ki. A kezelések elvégzése után a nem kezelt (kontroll) csoporttal szemben kiértékeljük a kezelések eredményét.
A) A kezelések után a mocsári csiga egyed szinten vizsgálható viselkedési mintázatai:
1) táplálkozási magatartás – a reszelő nyelv (radula) öltögetésében megvalósuló, az idegrendszer táplálkozási ritmusgenerátor sejtjei által szabályozott viselkedési mintázat.
A csiga szereti az édes ízt, így a cukor, mindig, minden körülmény között táplálkozási magatartást indukál. Ez a kiváltott táplálkozási magatartás, azaz a radula öltögetések száma egy egyszerű tükrös rendszer segítségével nyomon követhető. A kísérletek során számoljuk az egy adott időegység (pl. 2 perc) alatt megvalósuló harapások számát, mind a kontroll (kezeletlen), mind a (toxin kezelt) csoportok egyedeiben. A kapott eredményeket statisztikailag értékeljük.
2) légzési magatartás – a nagy mocsári csiga tüdős állat, így gázcseréje a légzőnyíláson (pneumostoma) keresztül a légköri levegőből történik (a bőrizomtömlőn keresztüli bőrlégzése is ismert). A légzési magatartás a légzőnyílás nyitásán és zárásán keresztül megvalósuló viselkedési mintázat, adott időegység alatt.
A véroxigén szint csökkenése hypoxiás állapotot idéz elő az állatban, amely stimulálja az idegrendszer erre érzékeny sejtjeit. Mindezek hatására az állat a felszínre kúszik, majd a pneumostoma nyitásával megtörténik a gázcsere. Annak végeztével zárja a nyílást és víz alá mászik ismét. A kísérlet során a víz oldott oxigén szintjét 4 mg/L alá visszük, így a bőrön keresztül lejátszódó gázcserét kizárjuk. A légvételek számát mind a kontroll (kezeletlen), mind a (toxin) kezelt csoportok egyedein számoljuk, adott időegység (pl. 15 perc) alatt. A kapott eredményeket statisztikailag kiértékeljük.
3) mozgási magatartás – a talpon elhelyezkedő csillók egy irányba történő elmozdulása következtében megvalósuló viselkedési mintázat.
A mozgási aktivitás nyomon követhető az állat által adott időegység alatt (pl. 5 perc) megtett út hosszának a jelölésével (kék marker). Az állatok által megtett utat digitalizáljuk, majd lemérjük azt egy program segítségével, végül megkapjuk a megtett út hosszát cm-ben, mind a kontroll (kezeletlen), mind a (toxin) kezelt csoportok egyedeinek esetében. A kapott eredményeket statisztikailag kiértékeljük.
4) tanulás és memória – a táplálkozási viselkedésre épülő, egyszeri társításos jutalmazásos (vagy éppen averzív) kondicionálás után lejátszódó ismert molekuláris folyamatok összessége, mely az idegrendszer plaszticitása alapján új sejt-sejt kapcsolatok kialakulását is generálja. Eredményeként kialakul az emléknyom (memória), amely adott esetekben, bizonyos stimulusokkal aktiválható.
Egyszeri társításos, jutalmazásos kondicionálás (tanulási paradigma). A tréning előtti tesztben (Pre-training test) megvizsgáljuk, hogy az állatok egy számukra közömbös kémiai ingerre, az amil-acetátra (kondícionáló stimulus, CS) mutatnak-e táplálkozási magatartást. Normális esetben az inger az állat számára közömbös, így nincs táplálkozás. A tréning során 2 percig társítjuk az amil-acetátot (CS) a cukorral (nem-kondicionáló stimulus, US), amely mindig, minden körülmények között táplálkozást indukál (robosztus inger). Így a tréning során megfigyelhető a táplálkozási ritmus. Az állat társítja a CS és US ingereket, megjegyzi azt, emléknyom alakul ki benne, amely jó esetben, ha tényleg tanult az állat, akkor pl. 24 órával később előhívható, felidézhető csak a CS alkalmazásával. Így tanult állatok esetében, az az amil-acetát (CS) amely kezdetben nem indukált táplálkozási magatartást, most képes beindítani azt. A tanulási vizsgálatokat a kontroll és a (toxin) kezelt csoportok esetében is elvégezzük. A kapott eredményeket statisztikailag kiértékeljük.
Sematikus ábra foglalja össze a cianotoxinok hatásvizsgálatában tervezett tanulási paradigmára épülő kísérleteket:
A vizsgálatokban az egyszeri társításos jutalmazásos kondicionáláson alapuló tanulási paradigmát használjuk, ahol a kezeletlen és ciantotoxin kezelt állatokban teszteljük az amil-acetáttal (CS) előhívott táplálkozási magatartást. A vizsgálatokat felnőtt állatokon és úgynevezett fél-intakt preparátumokon is elvégezzük. A fél-intakt preparátumokban érintetlenek a szenzoros receptor-mezők az ajak és tapogató régiókban (amelyek a kémiai stimulusokat [cukor, amil-acetát] képesek felfogni), valamint a szenzoros idegi pályák.
B) A kezelések után az idegsejtek szintjén vizsgálható sejtszintű változások:
A nagy mocsári csiga 11 idegdúcból (ganglionból) álló központi idegrendszere
Ezekben az idegdúcokban helyezkednek el azok az azonosított idegsejtek, amelyek kulcs szerepet játszanak az egyes viselkedési mintázatok kialakításában és szabályozásában. Számos ilyen idegsejtet ismerünk – pl. a táplálkozás szabályozásában a B3 (bukkális) motoneuronokat (ezek végzik a pofa izomzatának a beidegzését, amely a reszelő nyelv öltögetés ritmusos folyamatát szabályozza); az agydúc óriás idegsejtjét, a CGC-t (cerebral giant cell), amely egy táplálkozást koordináló szerotonin tartalmú interneuron (a tanulási folyamatokban is kiemelt szerepe van); a jobb lábdúc dorzális felszínen elhelyezkedő, dopamin tartalmú neuronját, az RPeD1-et (right pedal dorsal 1), ez többek között a légzési folyamatok szabályozásában is vesz részt; vagy a viszcerális idegdúc dorzális felszínén elhelyezkedő idegsejtet, a VD1-et.
A nagy mocsári csiga pofadúca (bukkális ganglion) a B3 motoros idegsejtekkel. Az azonosított B típusú motoros idegsejtek zöld színű fluoreszkáló festékkel vannak megtöltve.
A nagy mocsári csiga központi idegrendszerének (kivéve pofadúc) sematikus ábrázolása (bal oldalt) a különböző viselkedési mintázatokban azonosított idegsejtekkel (pirossal jelölve). A jobb oldalon az idegdúcok valós fotói, ahol nyilak jelölik az azonosított sejteket (CGC, RPeD1, VD1), valamint az adott idegsejtek megjelenítése zöld fluoreszcens festékkel (láthatók az idegnyúlványok).
Ezekben az azonosított idegsejtekben (B3, CGC, RPeD1, VD1) elemi idegjelenségeket (nyugalmi membránpotenciálokat, akciós potenciálokat, tüzelési mintázatokat, stb.), feszültség-vezérelt ion áramokat (nátrium-, kálium-, és kálcium-áramok), illetve sejt-sejt kapcsolatokat vizsgálhatunk modern elektrofiziológiai módszerekkel, összehasonlítva a kezeletlen és a cianotoxin kezelt egyedek idegsejtjének működéseit.
C) A cianotoxin kezelések után az azonosított idegsejtekben lejátszódó molekuláris szintű változásokat is nyomon követjük:
A CGC-ben a tanulás eredményeként kialakuló memóriafolyamatok molekuláris történései. A molekuláris folyamatok minden eleme ismert és azonosított a nagy mocsári csigában. Ezek a molekuláris kaszkádok evolúciósan konzervált folyamatok, így a gerincesekben is azonosak. A piros csillagok jelölik azokat a feltételezett támadáspontokat (pl. LymNMDA – nagy mocsári csiga NMDA receptora; Gs – serkentő G-fehérje; Gi – gátló G-fehérje), ahol a cianotoxinok (pl. BMAA) hatásukat kifejthetik a tanulás és memóriafolyamatokban.